Д.Ю.Рязанцев, Э.М.Чудинова, Л.Ю.Кокаева, С.Н.Эланский, П.Н.Балабко, Г.Л.Белова, С.К.Завриев
Фитопатогенді саңырауқұлақ Colletotrichum коккодтары картоп пен қызанақта антракноз және түйнектің қара дақтары деп аталатын қауіпті аурулар тудырады. Морфологиялық сипаттамалары бойынша оларды көбінесе басқа микроорганизмдер тудыратын аурулардан ажырату қиын; жасыл қызанақ жемістерінде ауру симптомсыз болуы мүмкін, ол тек піскен қызыл жемістерде көрінеді. Қоздырғышты тез және дәл диагностикалау үшін нақты уақыт режимінде ПТР тестілеу жүйесі ұсынылады. Сынақ жүйесін жасау үшін Ресейдің әр түрлі аймақтарындағы картоп түйнектерінен оқшауланған 45 С коккод штамдары бар глицерин трифосфатдегидрогеназа генінің нуклеотидтік реттілігі анықталды.
Алынған нәтижелер мен GenBank мәліметтер базасында қол жетімді басқа түрлердің осыған ұқсас тізбегін талдау негізінде C. коккодтары үшін түрге арналған праймерлер мен зонд жасалды. Құрылған тест жүйесінің ерекшелігін тексеру үшін ПТР қызанақ және картоп өсімдіктерімен (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes) байланысты 15 түрлі паразиттік және сапротрофты саңырауқұлақтардың таза дақылдарынан оқшауланған ДНҚ-мен жүргізілді. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes ДНҚ-ның болуы шектік циклде 20-27 аралығында анықталды, ал басқа түрлері 40 циклдан кейін анықталды немесе анықталмады. Сынақ жүйесі C. талданатын ПТР қоспасында 0.01 нг / мм3 асатын ДН-ның концентрациясын коккодтауды сенімді түрде анықтауға мүмкіндік береді. Дамыған тест жүйесін қолдана отырып, саңырауқұлақ ауруларының белгілері бар қызанақ жапырақтарында және аурудың сыртқы белгілері жоқ картоп түйнектерінде C. коккодтарының болуы зерттелді. Саңырауқұлақ инфекциясының белгілері бар жапырақтар Краснодар өлкесіндегі екі түрлі егістіктен, түйнектер - Кострома, Мәскеу, Калуга, Нижний Новгород облыстарындағы алқаптардан жиналды. Краснодар өлкесінде C. coccodes ДНҚ-сы бар бір томат жапырағы табылды; Кострома, Мәскеу, Калуга облыстарында өсірілген түйнектердің 5 үлгісінде осы қоздырғыштың ДНҚ-ның айтарлықтай болуы анықталды.
Кіріспе
Colletotrichum тұқымдасының саңырауқұлақтары - дәнді дақылдарға, көкөністерге, шөптерге, көпжылдық жемістер мен жидектер өсімдіктеріне әсер ететін қауіпті фитопатогендер. Бұл тұқымдастың барлық жерде кездесетін түрлерінің бірі - Colletotrichum коккодтары (Wallr).
Хьюз - картоп пен қызанақтың антракнозы мен қара дақының қоздырғышы және Solanaceae тұқымдасының басқа өсімдіктерінің ауруларын тудырады, соның ішінде. арамшөптер (Диллард, 1992). C. коккодтар өсімдіктің барлық жер асты бөліктерін, сабақ негіздерін, жапырақтары мен жемістерін зақымдайды (Андривон және басқалар, 1998; Джонсон, 1994). Инфекцияланған картоп түйнектерінің қабығында анық емес жиектері бар сұр дақтардың дамуы байқалады, оларда спора мен микросклеротияның қара нүктелері айқын көрінеді. Сақтау кезінде түйнектердің целлюлозасында жұмсартылған мазмұны бар жаралар пайда болуы мүмкін, яғни. ауру антракноз фазасына түседі, алайда бұл өте сирек кездеседі.
Сонымен бірге қызанақ жемістеріне антракноздың белгілері (теріде ұсақ қара нүктелері бар жаралар) тән. Жапырақтарда C. коккодтардың белгілері қара-сары дақтар түрінде көрінеді, әдетте сары тінмен шектеседі (Джонсон, 1994).
Түйнектердегі қара дақтың дамуы олардың сыртқы түрін бұзады, бұл әсіресе қызыл терімен жуылған картопты сату кезінде көрінеді. Қабыршақ қабыршақтануы артық булануға және сақтау шығындарының жоғарылауына әкеледі (Hunger, McIntyre, 1979). Өсімдіктердің басқа мүшелерінің зақымдануы өнімділіктің төмендеуіне әкеледі, бұл ашық та, жабық жерде де байқалды (Джонсон, 1994; Црор және басқалар, 1999). C. коккодтар тудыратын аурулар әлемде картоп өндіретін барлық дерлік аймақтарда, соның ішінде Ресейде кең таралған (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). С коккодтарға қарсы қолданыстағы фунгицидтердің тиімділігі жеткіліксіз болғандықтан және төзімді сорттардың болмауына байланысты бұл ауруларды бақылау қиынға соғады (Оқы, Жасыру, 1995).
C. коккодтар егісі тұқым түйнектерінде сақталуы мүмкін (Оқы және жасыр, 1988; Джонсон және басқалар, 1997), қызанақ тұқымдары (Бен-Даниэль және басқалар, 2010), топырақта, өсімдік қалдықтарында ұзақ уақыт тіршілік етеді (Диллард, 1990) ; Диллард, Кобб, 1993) және арамшөптерде (Raid, Pennypacker, 1987). Бірқатар авторлардың еңбектері (Оқыңыз, жасырыңыз, 1988; Баркдолл, Дэвис, 1992; Джонсон және басқалар, 1997; Диллард, Кобб, 1993) картоп пен қызанақтағы аурудың дамуы көбіне тұқымдағы егудің болуына және топырақ. Сондықтан аурудан шығынды азайту үшін саңырауқұлақтың тұқымдық материалдағы, топырақтағы, сақтауға қойылған картоп түйнектеріндегі және қызанақ тұқымындағы таралуын диагностикалау қажет (оның ішінде сандық). Топырақ пен өсімдік материалындағы морфологиялық диагностиканы тек басқа саңырауқұлақтар типтерінде кездесетін микросклеротиоздың қатысуымен ғана жүргізуге болады.
Түйнектегі белгілер Helminthosporium solani саңырауқұлақтарынан туындаған күміс қотырға өте ұқсас. Colletotrichum коккодтары мен Helminthosporium solani-ны таза дақылға бөлу өте қиын және қоректік ортада баяу өсуіне байланысты ұзақ уақытты алады. Colletotrichum коккодтарын тез анықтау үшін аспаптық диагностикалық әдістерді қолдану қажет. Ең қолайлы әдіс - полимеразды тізбекті реакция (ПТР) және оның модификациясы - нақты уақыттағы ПТР. Қазіргі уақытта британдық зерттеушілердің (Cullen et al., 2002) рДНҚ-ның ITS1 аймағы үшін жасаған тест жүйесі Еуропа мен АҚШ-та қолданылады. Оны қолдану ресейлік изоляттарды талдауда жақсы нәтиже көрсетті (Белов және басқалар, 2018). Алайда, C. коккодтары өте өзгермелі және оны бір ДНҚ тізбегінен анықтау жалған теріс нәтижелерге әкелуі мүмкін. Диагнозды сенімдірек ету үшін бірнеше түрге тән ДНҚ тізбегін талдау қажет, соған байланысты біз гликеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа генінің реттілігі бойынша коккодтарды анықтауға мүмкіндік беретін түпнұсқалық тест жүйесін жасадық.
Материалдар мен тәсілдер
Құрылған сынақ жүйелерінің тиімділігі мен ерекшелігін бағалау үшін біз қызанақ жапырақтары мен жемістерінің, картоп түйнектерінің ауру үлгілерінен авторлар бөліп алған саңырауқұлақтардың 15 түрінің таза дақылдарын қолдандық (кесте 1). Оқшаулау үшін саңырауқұлақ инфекциясының белгілері бар өсімдіктер мүшелері алынды, бұтаға бір органнан артық емес.
Қабығы бар түйнектің тілімі, қызанақ жемісінің тілімі және зардап шеккен жапырақ бинокулярлық микроскоптың астына қойылды, содан кейін мицелий, споралар немесе тіндердің бір бөлігі петри табақшасында агарланған ортаға (сусланы агар) өткір диссекциялық инемен ауыстырылды. Изоляттарды пробиркалардағы агар қиғаштарында 4 ° C температурада сақтаған.
Саңырауқұлақ ауруларының белгілері бар қызанақ жапырақтарының үлгілері жиналғаннан кейін дереу талдауға арналған (далада) 70% этил спиртіне орналастырылды, олар ДНҚ оқшауланғанға дейін сақталды. Картоп түйнектері зертханаға жеткізіліп, олардан тазартылды (2 × 1 см кесек) және –20 ° C температурада мұздатылды. ДНҚ оқшауланғанға дейін мұздатылған күйде сақталады.
ДНҚ оқшаулауға арналған саңырауқұлақтардың таза дақылдары сұйық бұршақ ортасында өсірілді. Саңырауқұлақтың мицелийі сұйық ортадан алынып, сүзгі қағазда кептіріліп, сұйық азотта тоңазытылған, гомогенизацияланған, CTAB буферінде инкубацияланған, хлороформмен тазартылған, изопропанол мен 0.5 М калий ацетатының қоспасымен тұндырылған және 2% спиртпен екі рет жуылған. Алынған ДНҚ ионсыздандырылған суда ерітіліп, –70 ° С температурада сақталды (Кутузова және басқалар, 20). ДНҚ концентрациясы Qubit 2017 (Qiagen, Германия) бойынша екі тізбекті ДНҚ үшін HS ДНҚ сандық жиынтығының көмегімен өлшенді. Алкоголизденген және мұздатылған сынамалар сұйық азотта тритурацияланды, содан кейін жоғарыда сипатталғандай ДНҚ экстракциясы жүргізілді (таза саңырауқұлақ дақылдарының мицелийі үшін).
Кесте 1. Қолданылған саңырауқұлақтар штамдарының шығу тегі
Саңырауқұлақтың атауы | Өсімдік, орган | Таңдау орны |
---|---|---|
Colletotrichum 1, C. коккодтар 2, C. коккодтар 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | картоп түйнектері | Кострома облысы, 1-ші дала ұрпағының картоп түйнектері, Red Scarlett сорты |
Colletotrichum коккодтар 4 | картоп парағы | Rep. Марий Эл, Йошкар-Ола |
Гельминтоспориум | картоп түйнектері | Магадан облысы, пос. Шатыр, картоп түйнегі |
Cladosporium fulvum | қызанақ жапырағы | Мәскеу облысы, ірі жемісті қызанақ |
Alternatia tomatophila | қызанақ жемісі | Бүкілресейлік өсімдіктерді қорғау ғылыми-зерттеу институтының микология және фитопатология зертханасының қызметкерлері ұсынды |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | қызанақ жемісі | Краснодар өлкесі, Крым ауданы, қаймақ |
Fusarium oxysporum | бидай тамыры | Мәскеу облысы |
ПТР DTprime күшейткішінде орындалды (DNA-Technology). ПТР үшін түпнұсқа праймерлер және глицерин трифосфатдегидрогеназа генінің типтік аймағына арналған зонд қолданылды: Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, кері Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1 праймері. Праймерлер 213 а.к. аймақты күшейтеді.
Реакция жалпы ДНҚ-ның 50 нг (жапырақтары мен түйнектерін талдау кезінде) және 10 нг (саңырауқұлақтардың таза дақылдарының ДНҚ-сында) алды. Реакция қоспасы (35 мкл) парафин қабаты арқылы екі бөлікке бөлінді: төменгі бөлігінде (20 мкл) 2 мкл 10 × реакциялық буфер болды (750 мМ Tris-HCl, рН 8.8; 200 мМ (NH4) 2SO4; 25 мМ MgCl2; 0.1% Tween-) 20), әр дезоксинуклеотид трифосфатының 0.5 мМ, әр праймерден 7 пмоль және гидролизденетін флуоресцентті зондтың 4 пмоль; жоғарғы бөлігінде 1 мкл 10 × ПТР буфері және 1 U Taq полимеразы болды.
Қоспаны парафинмен бөлу түтіктерді 5 ° C температурада ұзақ уақыт сақтауға және оларды 10 ° C-тан жоғары температурада 80 минут қыздырғаннан кейін ПТР үшін ыстық бастауды қамтамасыз етуге мүмкіндік береді. ПТР келесі бағдарлама бойынша жүргізілді: 94.0 ° C - 90 с (1 цикл); 94.0 ° C - 30 с; 64.0 ° C - 15 с (5 цикл); 94.0 ° C - 10 с; 64.0 ° C - 15 с (45 цикл); 10.0 ° C - сақтау.
Нәтижелер мен пікірталас
Глицерин трифосфатдегидрогеназа генінің дәйектілігі Ресейдің әр түрлі аймақтарындағы жапырақтардан, сабақтардан, картоп түйнектерінен және қызанақ жемістерінен (Кутузова, 45) оқшауланған 2018 штаммда анықталды. Барлық штамдардың зерттелген тізбектері екі нуклеотидтермен ерекшеленетін 2 топқа бөлінді. KY496634 және KY496635 нөмірлері бойынша екі топ өкілдерінің нуклеотидтік тізбегі GenBank-те сақталады.
BLAST бағдарламасының көмегімен кок70гдф, кок280гдр және олардың негізінде жасалған кокгдз зондтары тексерілді (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) Глицерин трифосфат дегидрогеназа генінің барлық тізбектерінде Colletotrichum тектес гендер және GenBank мәліметтер базасында қол жетімді басқа организмдер.
Праймерлер мен зондтарға жоғары гомологиялық басқа организмдердің ДНҚ аймақтары табылған жоқ.
Сынақ жүйесінің сезімталдығы әр түрлі концентрациясы бар С коккодты ДНҚ, антракнозбен зақымдалған картоп жапырағынан алынған ДНҚ (2017 жылы Мари Эльде жиналған, Қызыл Скарлетт сорты) және қара дақтан зардап шеккен түйнектер қабығы (Кострома облысында жиналған, әртүрлілік Red Scarlett, кесте 2). Түйнектер мен картоп жапырақтарында ДНҚ болуын растау үшін, олардан таза культураларға C. коккод штамдары бөлініп алынды.
Сынақ жүйесінің сезімталдықты талдау нәтижелері оның ПТР қоспасындағы жалпы мөлшері 0.05 нг-ден көп болған кезде оның үлгідегі C. коккодты ДНҚ болуын табысты диагностикалау үшін қолдануға болатындығын көрсетті. Бұл анықтау үшін жеткілікті, өйткені бір склероцияда орта есеппен 0.131 нг, ал бір спорада шамамен 0.04 нг ДНҚ болады (Каллен және басқалар, 2002). Британдық топ жасаған тест жүйесі (Cullen және басқалар, 2002) ұқсас сезімталдығын көрсетті (34 нг ДНҚ-да 0.05 шекті цикл және 37 нг-да 0.005).
Құрамында C. коккодтары бар табиғи үлгілерді талдау барлық жағдайда оның қатысуын сенімді түрде анықтауға мүмкіндік берді (2-кесте). Ұсынылған ДНҚ оқшаулау әдісі табиғи өсімдік үлгілерін талдау үшін де қолданылды.
Кесте 2. Нақты уақыттағы ПТР үшін Colletotrichum коккодтарын сәйкестендіру үшін ұсынылған сынақ жүйесінің сезімталдығын анықтау
Үлгі | Үлгідегі ДНҚ мөлшері *, нг | Шекті цикл | C. коккодты анықтау |
---|---|---|---|
Мицелий Colletotrichum коккодтары | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Түйнек қабығы 1 | 50 | 32 | + |
Түйнек қабығы 2 | 50 | 30 | + |
Түйнек қабығы 3 | 50 | 31.5 | + |
Картоп жапырағы | 50 | 29.5 | + |
Ескерту. * ПТР өнімдерінің қоспасында.
Сынақ жүйесінің ерекшелігі саңырауқұлақтың 15 түрінен алынған ДНҚ сынамаларында тексерілді. Саңырауқұлақтардың барлық штамдарын авторлар зақымдалған және сау жемістер мен қызанақ, картоп түйнектерінің жапырақтарынан бөліп алды; бидайдың тамырынан бір штамм бөлініп алынды (1-кесте). Жеміс бетінен оқшауланғандар арасында қызанақ үшін патогенді емес түрлері бар (мысалы, Феллинус ферругинеовелутин).
Зерттеулер көрсеткендей, C. коккодты ДНҚ 20-27 шекті циклде анықталды, ал басқа саңырауқұлақ түрлері анықталмады немесе 40 циклдан кейін сигнал берді, оны ерекше емес шуыл әсеріне жатқызуға болады (3-кесте).
Кесте 3. Әр түрлі саңырауқұлақтарға арналған тест жүйесін тексеру
Саңырауқұлақтың атауы | Шекті цикл |
Colletotrichum коккодтары 1 | 20.9 |
C. коккодтар 2 | 22.6 |
C. коккодтар 3 | 23 |
C. коккодтар 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Ризоктония солани | > 40 |
Phomopsis phaseeoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
Томатофила | > 40 |
Гельминтоспориум | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Стефилий весикариумы | > 40 |
Ilonectria crassa | > 40 |
Кладоспорий кладоспориоидтары | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Акродонтия лузулалары | > 40 |
Penicillium SP. | > 40 |
Ескерту. * Барлық үлгілердегі ДНҚ мөлшері 10 нг құрады.
Жасалған сынақ жүйесі қызанақ жапырақтары сынамаларында некротрофты қоздырғыштар белгілері бар және картоптың тұқымдық тұқымдары көрінбейтін симптомдарымен C. коккодтарын анықтау үшін қолданылды. Зерттеу үшін біз Кострома, Мәскеу, Калуга, Нижний Новгород облыстарында өсірілген әр түрлі сортты тұқым түйнектерін алдық. Үлгілерде C. коккодты ДНҚ-ның болуы маңызды деп саналды, олардың анализінде шекті цикл 35-тен аспады. Бұл шекті мән 0.05 нг С коккодты ДН-ны сенімді анықтау негізінде таңдалды (шекті цикл 33.5, 2-кесте) және 40-тан жоғары шекті циклдар, кейбір басқа саңырауқұлақтар түрлерінің ерекше емес ДНҚ-сы диагнозы қойылды. Осы тәсілмен Кострома, Мәскеу, Калуга облыстарында өсірілген түйнектердің 5 үлгісінде және Краснодар облысының Ейск ауданынан шыққан бір томат жапырағында C. coccodes ДНҚ-ның айтарлықтай болуы анықталды (кестелер 4, 5).
Кесте 4. Colletotrichum коккодтарын картоп түйнегінде анықтау *
Үлгі нөмірі | Картоптың әртүрлілігі | Өсу орны | C. коккодты анықтау | Шекті цикл |
---|---|---|---|---|
1 | Қызыл алқызыл | Кострома обл | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Санте | Мәскеу облысы | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Жуковский ерте | Мәскеу облысы | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Молли | Калуга облысы. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Фэнтези | Калуга облысы. | - | |
15 | Гала | Нижний Новгород облысы. | - | |
16 | - |
Ескерту. * Барлық үлгілердегі ДНҚ мөлшері 50 нг құрады.
Кесте 5. Қызанақ жапырағында Colletotrichum коккодтарын анықтау *
Үлгі нөмірі | Өсу орны | C. коккодты анықтау | Шекті цикл |
---|---|---|---|
1 | Краснодар өлкесі, Қырым ауданы | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Краснодар облысы, Ейск ауданы | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Барлық үлгілердегі ДНҚ мөлшері 50 нг құрады.
Біз жасаған тест жүйесі британдық зерттеушілер жасағаннан (Каллен және басқалар, 2002) сезімталдығымен және ерекшелігімен кем түспейді және өсімдік үлгілерін талдауға жарамды. Оны тұқым түйнектерін талдауға қолдану сыртқы зақымдану белгілері жоқ түйнектердегі C. кокодты ДНҚ-ны анықтауға және жапырақтардың инфекциясын ойдағыдай талдауға мүмкіндік берді.
Бүгінгі күні Ресейде C. коккодтарының зақымдануы үшін картоп түйнектеріне талдау жүргізілген жоқ. Біздің алғашқы зерттеуіміз көрсеткендей, Ресей Федерациясының әртүрлі аймақтарында өсірілген 16 сыналған тұқым түйнектерінің 5-інде C. коккодтары бар. Бұл картоп түйнектерінің қара дақтары Ресейде кең таралған картоп ауруы екенін және оның картоп дақылдарының көлемі мен сапасын төмендетудегі рөлі төмен бағаланғанын көрсетеді.
Томат жапырақтарын талдау Краснодар өлкесінің Ейск ауданынан бір жапырақта C. коккодты ДНҚ-ның айтарлықтай болуын анықтады. Бұрын Ресейдің оңтүстігіндегі қызанақ егістерін британдық тестілеу жүйесін (Cullen et al., 2002) қолданған кезде, құрамында C коккодтары бар жапырақтар анықталды, ал кейбір өрістерде C. coccodes жұқтырған жапырақтардың жоғары үлесі табылды (Белов және басқалар.) 2018). Мәскеу облысының Краснодар және Приморский аумағында біз қызанақ жемістерін таптық, олардан C. коккодтардың таза дақылдарын бөліп алдық. Мүмкін, C. коккодтар Ресейде қызанаққа қазіргі кездегіден әлдеқайда кең таралған және оның зияндылығы да бағаланбайды.
Осылайша, бүгінгі күні картоп пен қызанаққа C. коккодтарының кең таралуы туралы жеткілікті ақпарат жинақталды.
Бұл саңырауқұлақтың картоп пен қызанақ ауруларын дамытудағы рөлін жақсы түсіну үшін оның Ресейде таралуын қадағалап, топырақ пен тұқым инфекциясының рөлін, сақтау кезінде жоғалтудағы қара дақтың рөлін зерттеу қажет. ПТР диагностикасын қолдану бұл жұмысты едәуір жеңілдетуі мүмкін, және екі сынақ жүйесін де бір уақытта қолдану талдаудың дәлдігін едәуір арттырады.
Бұл жұмыс Ресейдің ғылыми қорының No18-76-00009 грантымен қолдау тапты.
Мақала «Микология және фитопатология» журналында жарияланған (54 том, No1, 2020).