ЖЕҢІЗ. Чудинов, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Эланский
Жақында аскомицет саңырауқұлақтары Ilyonectria crassa картоп түйнектерін жұқтыруға қабілетті екендігі дәлелденді. Бұл жұмыс картоптан оқшауланған I. crassa штаммының биологиялық сипаттамалары мен кейбір фунгицидтерге төзімділігін талдаған алғашқы еңбек. «Картоп» штаммының түрге тән аймақтарының дәйектілігі нарцодил, женьшень, көктерек және бук, тамыр лалагүлі мен қызғалдақ жапырақтары тамырларынан оқшауланған саңырауқұлақтар үшін бұрын алынғанға сәйкес келді. Шамасы, көптеген жабайы және бақша өсімдіктері I. crassa қорығы бола алады. Зерттелген штамм қызанақ пен картоп кесектерін жұқтырды, бірақ бүкіл қызанақ жемісі мен бүлінбеген картоп түйнегін жұқтырмады. Бұл I. crassa жараның паразиті екенін көрсетеді. Флудиоксонилге, дифеноконазолға және азоксистробинге төзімділікті қоректік ортада бағалау осы дәрілердің жоғары тиімділігін көрсетті.
EC50 индикаторы (фунгицидтің концентрациясы, колонияның фунгицидтік емес бақылауға қарағанда радиалды өсу жылдамдығынан 2 есе төмендейді) 0.4-ке тең болды; Тиісінше 7.4 және 4 мг / л. Картоп түйнектерін фитопатологиялық бағалау және өсімдіктерді қорғау шараларын әзірлеу кезінде I. crassa қоздыратын аурудың даму мүмкіндігін ескеру қажет.
Фитопатогендік микроорганизмдердің дамуы картопты өсіру мен сақтаудың барлық сатыларында үлкен шығындарға әкеледі. Қорғаныс шараларын жоспарлау кезінде, әдетте, альтернатива, фузариум, фома, гельминтоспориум, коллетотричум, фитофтора және т.б түрлері сияқты белгілі қоздырғыштар ескеріледі, алайда соңғы жылдары картопта жаңа фитопатогендік микроорганизмдердің пайда болуы туралы хабарламалар көбірек пайда болды. Олардың биологиясы нашар зерттелген, картопқа қолданылатын фунгицидтердің оларға қатысты тиімділігі белгісіз, диагностикалық әдістер әзірленбеген. Жаппай даму кезінде олар картоп дақылына айтарлықтай зиян келтіруі мүмкін. Осы микроорганизмдердің бірі - картоп түйнектерінде авторлар алғаш тапқан Ilyomectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous аскомицет саңырауқұлағы (Chudinova және басқалар, 2019).
Бұл жұмыста картоп түйнектерінен оқшауланған I. crassa штаммын талдау нәтижелері көрсетілген. I. crassa колониялары мен мицелиялық құрылымдарының морфологиясы, түрге тән ДНҚ аймақтарының нуклеотидтік тізбегі, картоп пен қызанақтың вируленттілігі және кейбір танымал фунгицидтерге төзімділігі зерттелді.
Материалдар мен тәсілдер
Біз Кострома облысында өсірілген картоп түйнегінен 18 жылы оқшауланған I. crassa 2KSuPT2018 штамын қолдандық. Түйнекке ашық қоңыр мицелиймен жабылған қуысы бар құрғақ шірік түрі әсер етті. Стерильді бөлшектейтін инені қолданып, саңырауқұлақ мицелийі агарлы ортасы бар (сыра сусласы 10%, агар 1.5%, пенициллин 1000 У / мл) Петри табағына құйылды. Пластиналар қараңғыда 24 ° C температурада инкубацияланды.
ICC2500 HD сандық фотокамерасы бар Leica DM50 жарық микроскопы және IC80HD сандық камерасы бар Leica M80 бинокулярлық микроскопы (Leica Microsystems, Германия) суретке түсіру, споралар мен споралар органдарының мөлшері мен морфологиясын бағалау үшін пайдаланылды.
ДНҚ-ны бөліп алу үшін саңырауқұлақ мицелийі сұйық бұршақ ортасында өсірілді, содан кейін сұйық азотта мұздатылды, гомогендендірілді, CTAB буферінде инкубацияланды, хлороформмен тазартылды және 2% спиртпен екі рет жуылды.
ДНҚ-ны бөліп алу әдісі Кутузова және басқалардың мақаласында егжей-тегжейлі сипатталған. (2017).
Түрді молекулалық әдістермен анықтау және басқа белгілі I. crassa штамдарымен салыстыру үшін ПТР түрге тән ДНҚ аймақтарын күшейтуге мүмкіндік беретін праймерлермен жүргізілді: ITS1-5,8S-ITS2 (праймерлер ITS5 / ITS4, Уайт және басқалар, 1990), гендік аймақтар б. -тубулин (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) және трансляцияның созылу коэффициенті 1α (tef1α) (праймерлер EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). Evrogen CleanUp жиынтығының көмегімен гельден қажетті ұзындықтағы ампликондар алынды. Күшейтілген аймақтар BigDye® Terminator v3.1 цикл тізбегін (Applied Biosystems, CA, USA) пайдаланып 3730 xl автоматты секвенсорында (Applied Biosystems, CA, АҚШ) қолданбалы биосистемада реттелді. Алынған нуклеотидтер тізбегі АҚШ Ұлттық Биотехнологиялық Ақпарат Орталығының (NCBI) GenBank дерекқорынан сәйкестікті іздеу үшін пайдаланылды. Филогенетикалық талдау MEGA 6 бағдарламасын қолдану арқылы жүргізілді (Tamura және басқалар, 2013).
Вируленттілікті анықтау ірі жемісті қызанақтың (Дубрава сорты) және картоп түйнектерінің (Гала сорты) жасыл жемістерінде жүргізілді. Сонымен қатар, бүлінген жемістер мен түйнектердің зақымдануын модельдеу үшін біз сол жемістер мен түйнектердің кесектерін қолдандық. Түйнектердің тіліктері ылғалды камераларға орналастырылды, олар төменгі жағында сулы фильтр қағазы бар Петри ыдыстары болды. Қағазға слайд қойылды, оған өз кезегінде түйнектердің немесе жемістердің тілімдері қойылды. Тұтас түйнектер мен жемістерді төменгі жағында сулы сүзгі қағазы бар контейнерлерге салған. Кесектің ортасында (немесе түйнектің немесе жемістің бүлінбеген бетінде) 5 күн сусланы агарда өсіргеннен кейін саңырауқұлақ гифалары бар агардың бөлігі (5 × 5 мм) орналастырылды.
Саңырауқұлақ штамдарының фунгицидтерге төзімділігін бағалау зертханалық жағдайда агарды қоректік ортада жүргізілді. Максим, КС фунгицидтік дәрі-дәрмектерге (флудиоксонилдің белсенді ингредиенті, 25 г / л), Квадрис, КС (азоксистробин 250 г / л), Скор, ЕС (дифеноконазол 250 г / л) сезімталдығын зерттедік (Мемлекеттік каталог ..., 2020). Петри ыдыс-аяқтарында 0.1 белсенді зат концентрациясында зерттелген дәрілік заттарды қосып, сусланы-агар ортасында бағалау жүргізілді; бір; 1 ppm (мг / л) (флудиоксонил және дифеноконазол үшін), 10; он; 1 ppm (азоксистробин үшін) және фунгицидсіз ортада (бақылау). Фунгицид балқытылған ерітіндіге қосылды және 10 ° C ортаға дейін салқындатылды, содан кейін орта Петри ыдыстарына құйылды. Саңырауқұлақ мицелиясы бар агар блогы Петри табағының ортасына орналастырылып, қараңғыда 100 ° С температурада өсірілді. 60 күндік инкубациядан кейін колониялардың диаметрлері екі өзара перпендикуляр бағытта өлшенді; әрбір колония үшін өлшеу нәтижелері орташа болды. Тәжірибелер үш данада жасалды. Талдаулардың нәтижелері бойынша EC24 фунгицидтің концентрациясына тең есептелді, бұл фунгицидтік бақылауға қатысты колонияның радиалды өсу жылдамдығын екі есе азайтты.
Нәтижелер мен пікірталас
Саңырауқұлағы бар Петриден жасалған тағамдарда саңырауқұлақтар ақ түсті мицелиймен колониялар түзді. Мицелий астындағы орта қызыл-қоңырға айналды. Ортаның құрғауы кезінде саңырауқұлақтар кішігірім спородохияда жалғыз және біріктірілген конидиофораларда екі типтегі споралар түзді. Макроконидиялар ұзартылған, цилиндр тәрізді, бір-үш септа, орташа ұзындығы 27.2 мкм, диапазоны 23.2-ден 32.2 мкм-ге дейін, ені - 4.9 мкм-ге дейін (1-сурет). Микроконидиялардың орташа ұзындығы 14.3 мкм, диапазоны 10.3-тен 18.1 мкм-ге дейін, ені 4.0 мкм-ге дейін. Барлық макро- және микроморфологиялық таңбалар Ilyonectria crassa түрлерінің өзгеру диапазонына сәйкес келеді (Кабрал және басқалар, 2012).
Түрлерге тән ДНҚ аймақтарының тізбегі (ITS, b-тубулин, TEF 1α) біз бұрын зерттеген I. crassa штамдарының тізбектерімен толығымен сәйкес келді (Чудинова және басқалар, 2019, 1-кесте). I. crassa-ның басқа аймақтарда таралуын зерттеу және зардап шеккен дақылдардың спектрін талдау үшін GenBank мәліметтер базасындағы ұқсас ДНҚ тізбектері талданды (1-кесте). Қабаттасу 86-дан 100% -ке дейін болды. «Картоп» I. crassa штамының барлық үш ДНҚ аймағының дәйектілігі Нидерландыдағы лилия баданасы мен нарцисс тамырларынан және Канададағы женьшень тамырынан оқшауланған штаммдардың тізбегімен бірдей болды. Біз ашық деректер базасында аналогтық үш дәйектілігі бар басқа I. crassa штамдарын таба алмадық. Алайда депонирленген ITS және b-тубулин тізбегін талдау Ұлыбританияда қызғалдақ жапырақтарында I. crassa бар екенін көрсетті. Канададағы көктерек тамырлары мен Италиядағы бук тамырларының микобиотасын және Сауд Арабиясындағы картоп түйнектерін талдау кезінде ұқсас ITS дәйектілігі бар саңырауқұлақтар анықталды (1-кесте). Осы зерттеудің нәтижелері I. crassa-ның ғаламдық таралуына ие екенін және әртүрлі өсімдік түрлерін жұқтыруға қабілетті екенін көрсетеді.
5-ші күні қызанақ пен картоп кесектерінде патогенділікті анықтаған кезде зақымданудың диаметрі 1.5 см-ге жетті.Зерттелген штамм бүкіл қызанақ жемісі мен бүлінбеген картоп түйнегін жұқтырмады. Алайда, қызанаққа сепальдар әсер етті. Ластану мүмкіндігін болдырмау үшін картоп түйнек кесіндісінде дамыған мицелийден саңырауқұлақ изоляты таза дақылға бөлініп алынды. Бұл ата-аналық штаммға толығымен ұқсас болды. Шамасы, I. crassa - жаралы паразит.
Тұқым түйнектерін отырғызар алдында фунгицидтермен емдеу өсімдік кезеңінде өсімдіктерде аурудың дамуын төмендетеді. Тиімді фунгицидтерді таңдау үшін олардың қайсысы I. срасаға қарсы тиімді екенін бағалау маңызды. Жұмыста фунгицидтердің кең таралған белсенді заттары - флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол зерттелді. Флудиоксонил отырғызу алдында тұқымдар мен тұқым түйнектерін киіндіру үшін қолданылатын бірнеше қоспаларға кіреді. Флудиоксонил (Максим) тұқым түйнектерін сақтауға дейін өңдеу үшін де қолданылады. Дифеноконазол мен азоксистробин тұқым материалын өңдеуге қолданылатын бірқатар препараттарға, сондай-ақ өсімдік өсімдіктерін өңдеуге арналған препараттарға енгізілген (Мемлекеттік каталог ..., 2020).
I. crassa өсу жылдамдығы әр түрлі белсенді заттардың концентрациясы бар орталарда (2-сурет) зерттелді: флудиоксонил (EC50 = 0.4 ppm), азоксистробин (EC50 = 4 ppm) және дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (2-кесте). Бұл препараттарды I. crassa-ға қарсы тиімділігі жоғары деп санауға болады, өйткені олардың EC50 түйнектерді емдеуге қолданылатын жұмыс сұйықтығындағы препараттың ұсынылған концентрациясынан едәуір төмен. Мемлекеттік каталогқа сәйкес ... (2020) картоп түйнектерін емдеуге арналған сұйықтықтағы флудиоксонилдің концентрациясы 500-ден 1000 промиллеге дейін, азоксистробин (бороздың түбін өңдеуге арналған сұйықтықта) - 3750-9375 ppm, дифеноконазол (вегетативті өсімдіктерді емдеуге арналған сұйықтықта) - 187.5– 625 бет / мин.
Кесте 1. GenKS базасында қол жетімді 18KSuPT2 және Ilyonectria crassa штамдарының штаммдарының түрге тән тізбегінің дәйектілігі
Штамм | Хост зауыты, шығарылатын жер | GenBank-ке салынған реттік нөмірлер, ұқсастықтардың пайызы | байланыс | ||
ITS | β-тубулин | TEF 1α | |||
17KSPT1 және 18KSuPT2 | Картоп түйнегі, Кострома облысы | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Чудинова және басқалар, 2019, бұл жұмыс |
CBS 158/31 | Нарцисс тамыры, Нидерланды | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Кабрал және басқалар, 2012 |
CBS 139/30 | Лалагүл шамы, Нидерланды | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Женьшень тамыры, Канада | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Қызғалдақ жапырағы, Ұлыбритания | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Н.Д | Дентон, Дентон, 2014 ж |
MT294410 | Аспен тамырлары, Канада | MT294410 100 | Н.Д | Н.Д | Рэмсфилд және басқалар, 2020 |
ER1937 | Бук, Италия | KR019363 99.65 | Н.Д | Н.Д | Тиззани, Хэги, Мотта. Тікелей жіберу |
ҚАУФ19 | Картоп түйнегі, Сауд Арабиясы | HE649390 98.3 | Н.Д | Н.Д | Гашгари, Гербави, 2013 |
ND = депонирленбеген
Кесте 2. Ilyonectria crassa фунгицидтерге төзімділігі
(белсенді зат) | EC50, ppm | ||||
3 күн | 5 күн | 7 күн | |||
Басқару элементтері | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Квадрис, KS (фоксистробин) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Максим, KS (флудиоксонил) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Skor, EC (дифеноконазол) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
Біздің жұмысымызда I. crassa штамдары Кострома және Мәскеу (Чудинова және басқалар, 2019) аймақтарындағы картоп түйнектерінен оқшауланған. Сауд Арабиясындағы картоп түйнектерінің микобиотасын талдау кезінде I. crassa-ға ұқсас ITS дәйектілігі бар саңырауқұлақ штамдарының жоғары үлесі анықталды (Гашгари және Гербави, 2013). Шамасы, I. crassa картопта сирек емес, көрінуі мүмкін. Біздің тәжірибелеріміз саңырауқұлақтың зақымдалған қызанақ жемістерін жұқтыруы мүмкін екенін көрсетті. Әдебиеттерден I. crassa топырақта сапротрофты түрде дамуға қабілетті екендігі белгілі (Moll және басқалар, 2016), сонымен қатар әр түрлі өсімдіктерге әсер етеді, тіпті нарциссилер, лалагүлдер, женьшеньдер, көктеректер, буктар сияқты таксономикалық тұрғыдан алыстағы өсімдіктер (1-кесте). бір). Шамасы, көптеген жабайы және бақша өсімдіктері I. crassa қорығы бола алады. Жоғарыда айтылғандар қорғаныс шараларын әзірлеу кезінде картоп түйнектеріне осы саңырауқұлақтың әсер ету мүмкіндігін ескеру қажет екенін көрсетеді. Құрамында флудиоксонил, азоксистробин және дифеноконазол бар картоп түйнектерін емдеуге арналған кең дайындықтар I. crassa-ға қарсы фунгицидтік тиімділікті көрсетті.
Бұл жұмысты Ресейдің іргелі зерттеулер қоры қолдады (Грант № 20-016-00139).
Мақала «Өсімдіктерді қорғау бюллетені» журналында жарияланған, 2020 ж., 103 (3)